高保真PCR酶KODPlusNeo

浏览量: 141   / 时间:2019-12-15   /作者:线上体育平台

KOD-Plus-Neo在高保真性PCR酶KOD-Plus-系列技術的基礎上,應用了本公司新開發的「延伸增強劑」,保持了KOD-Plus-系列高保真性(約為Taq的80倍)的同時,通過抑制,明顯提高了對微量模板DNA、長目的片段的擴增效率。

KODDNApolymerase具有強有力的3’→5’核酸外切酶活性(校正活性),可準確地對目的片段進行擴增,作為克隆用PCR酶獲得了廣泛的好評。然而,高保真性PCR酶在20〜30循環以后,容易出現擴增無法持續的。

以HeLa細胞來源的TotalRNA逆轉錄后得到的cDNA(TotalRNA50ng相當)為模板,對各種蛋白激酶的ORF(openreadingframe)的全長擴增。反應根據各PCR酶的推薦條件進行了30個循環。結果可見,只有用KOD-Plus-Neo的情況下,所有的基因都能得到明亮的擴增產物,所有的ORF都能迅速地進行克隆。

以人基因組DNA(50ng)為模板,對各種長度的β-globin基因進行擴增。反應按各PCR酶的推薦條件,進行了30個循環。結果顯示,只有用KOD-Plus-Neo的情況下,17.5kb的片段能確認得到明亮的條帶。而且,17.5kb以下的片段,用KOD-Plus-Neo的得率要高得多。

1)M.Takagietal.,Appl.Environ.Microbiol.,63:4504-4510(1997)2)H.Hashimotoetal.,J.Biochem.(Tokyo),125:983-986(1999)3)H.Mizuguchietal.,J.Biochem.(Tokyo),126:762-768(1999)4)M.Nishiokaetal.,J.Biotechnol.,88:141-149(2001)5)H.Hashimotoetal.,J.Mol.Biol.,306:469-77(2001)6)T.Imanakaetal.,J.Chin.Inst.Chem.Engrs.,32:277-288(2001)

【KOD-401】KOD-Plus-Neo(1U/μl)200μl×1支10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo[KOD-4B]1ml×1支25mMMgSO4[KOD-2S]1ml×1支2mMdNTP[NTP-201]1ml×1支

滅菌蒸餾水Xμl2mMdNTPs5μl25mMMgSO43μl10pmol/μlPrimerF1.5μl10pmol/μlPrimerR1.5μlKOD-Plus-Neo(1.0U/μl)1μlGenomicDNA~200ngPlasmidDNA~50ngcDNA~200ng(RNA相當)10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo5μl

〈2StepCycle〉*94℃2min.↓98℃10sec.68℃30sec./kb25~45cycles〈3StepCycle〉*94℃2min.↓98℃10sec.Tm℃30sec.68℃30sec./kb25~45cycles〈StepDownCycle〉*94℃2min.↓98℃10sec.74℃30sec./kb5cycles↓98℃10sec.72℃30sec./kb5cycles↓98℃10sec.70℃30sec./kb5cycles↓98℃10sec.68℃30sec./kb15~30cycles↓68℃7min.*引物的Tm值高于63℃的情況下,請用兩步法。引物的Tm值在63℃以下,或用兩步法無法確認到擴增時,請嘗試用三步法。此外,當擴增產物出現雜帶或彌散時,請嘗試Stepdown方法。

●PCR條件的設定酶的標準使用量為50μl反應體系1U。延伸反應在68℃條件下進行,按1kb目的片段1min.的標準。出現拖尾條帶時,可降低MgSO4濃度,無法確認到擴增時,可提高MgSO4濃度。●高GC含量的模板反應液中添加終濃度為2〜5%的DMSO可得到改善。●以RT反應液為模板的情況過量帶入RT反應液有可能會對PCR反應產生抑制作用。建議帶入到PCR的RT反應液在PCR反應液的1/25以下(最好在1/50以下)。這樣就無需考慮RT反應液中Mg2+、dNTPs的影響,只要按照基本反應條件添加本酶中添付的dNTPs和MgSO4即可。