2個案例告訴你酵母雙雜交低溫脅迫那些事兒

浏览量: 149   / 时间:2020-05-01   /作者:线上体育平台

在植物研究領域,植物逆境研究一直都是熱點,线上体育平台在人口眾多,環境多樣性復雜的地球生態中,獲得有優良抗性的品種,對于農作物,經濟作物,觀賞植物都是極具科研和經濟價值的。在這一領域,酵母雙雜交技術因為其廣譜適應性、實驗操作易行、成本相對較低等特點,發揮了重要作用。小編會從低溫脅迫,高溫脅迫,鹽脅迫,干旱脅迫,抗病蟲害5個方面舉例說明。今天先介紹低溫脅迫,案例選自歐易生物客戶2019年發表的文章。

AnappleMYBtranscriptionfactorregulatescoldtoleranceandanthocyaninaccumulationandundergoesMIEL1-mediateddegradation--PlantBiotechnologyJournal

文章中發現MdMYB308L可以與MdbHLH33相互作用,同時可以增強MdbHLH33與MdCBF2(耐寒相關基因)和MdDFR(花青素合成相關基因)啟動子的結合性,提高基因表達量,對蘋果抗寒性和花青素積累具有正向調控作用。而MdMIEL1(MYB30-INTERACTINGE3LIGASE1)可以與MdMYB308L互作,促進其泛素化降解,對蘋果抗寒性有負調控作用。作者通過正負調控和正反驗證實驗,明確闡釋了MdMYB308L在蘋果抗寒反應中的作用機制。

階段一通過轉錄組測序,找到了低溫脅迫后差異表達基因MdMYB308L。然后在單基因功能層面,使用MdMYB308L過表達和抑制表達的轉基因愈傷組織和模式植物擬南芥,從抗寒表型和花青素積累上進行了直接研究。(低溫脅迫處理方法可見原文)

階段二,從正調控上研究MdMYB308L是如何起作用的。有文獻報道,MdbHLH33在蘋果抗寒和花青素積累上也均起正調控作用,提出假想MdMYB308L是否是通過直接與MdbHLH33發生互作,發揮其生物學功能的?在證明兩個蛋白是否互作上,首先就使用了酵母雙雜交技術,驗證結果為陽性。接著通過pull-down、BiFC進一步驗證,結果陽性。

在MdMYB308L過表達和抑制表達轉基因植株中,MdbHLH33表達量并無明顯差異,而通過EMSA實驗發現,MdMYB308L原來是通過促進MdbHLH33對下游基因的激活作用,實現抗寒和花青素積累功能的。而且,通過沉默MdbHLH33基因,立博体育在過表達MdMYB308L轉基因植株抗寒表型和花青素含量上仍有一定增加,說明MdMYB308L的靶基因不止MdbHLH33一個。

階段三,從負調控上研究MdMYB308L是如何起作用的。在該階段,不得不說酵母雙雜交實驗發揮了至關重要的作用。作者將MdMYB308L作為誘餌,通過酵母雙雜交實驗篩選蘋果文庫,獲得了陽性互作基因MdMIEL1。并通過一對一互作驗證,進一步證明了這兩個基因在酵母細胞中存在互作。

MdMIEL1編碼RINGE3泛素連接酶,有文獻報道MdMIEL1在抗氧化、抗鹽脅迫以及花青素積累上都起負調控作用。且證實MYB30,MYB98和MYB1是MIEL1的泛素化底物。于是,作者又提出假想:MdMIEL1是否也對MdMYB308L進行了泛素化修飾,調控其蛋白降解呢。結果通過體內外泛素化模式實驗證實了假想成立,同時對MdMIEL1過表達和抑制表達的轉基因植株(母株為MdMYB308L過表達的蘋果愈傷和擬南芥植株)的抗寒表型、花青素含量檢測分析進一步證實了結論。

BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2NegativelyRegulatestheStabilityofTranscriptionFactorICE1inResponsetoColdStressinArabidopsis--ThePlantCell

為了研究BIN2(BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2)在植物應對低溫脅迫反應過程中的作用機制,本文以酵母雙雜交實驗作為切入方法開展研究。具體為以BIN2為誘餌基因,將其構建于pGBKT7載體并轉化進AH109酵母細胞中,篩選野生型擬南芥cDNA文庫,獲得了陽性互作基因ICE1。并進一步驗證了ICE1截斷體與BIN2的互作情況,在酵母細胞中證明是ICE1蛋白C端結構與BIN2存在相互作用。另外,BIN2的同源基因BIN2-LIKE1和BIL2在酵母細胞中也與ICE1互作,且通過pull-down和Co-IP實驗進行了證實。

ICE1(INDUCEROFCBFEXPRESSION)從名字可看出,該蛋白是CBF蛋白表達的誘導物,也就是說ICE1作為轉錄因子可與CBF啟動子結合,激活CBF的表達(文章中也通過EMSA實驗進行了驗證,CBF是植物抗寒相關重要基因,在案例1中也有研究到其同源基因MdCBF2)。

我們都知道蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍,也是最重要的機制。蛋白質磷酸化主要發生在兩種氨基酸上,一種是絲氨酸,另一種是酪氨酸。而作者也通過體內外磷酸化實驗,證明了BIN2確實是與ICE1互作且使ICE1磷酸化了,其主要的磷酸化位點為ICE1S94A。以ICE1S94A突變體進行對比研究,發現在低溫鍛煉減弱期(復蘇期)BIN2通過使ICE1磷酸化,促進其與E3泛素連接酶HOS1結合,加快ICE1的泛素化降解進程,導致CBF表達下調,實現植物在抗寒與生長之間的平衡(意思就是春天到了,冰雪消融,可以開始茁壯生長了)。而在低溫鍛煉初期,BIN2表達量是低水平的,ICE1含量較高,促使CBF高表達,增強植物抗寒能力(冬天來了,該冬眠了)。

ProposedModeloftheRoleofBIN2inModulatingCold-StressResponsesthroughRegulatingICE1StabilityinArabidopsis.