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浏览量: 99   / 时间:2019-12-15   /作者:线上体育平台

(1)全基因合成:一般對于分子較小而又不易得到的基因采用該方式。可將雙鏈基因分成若干寡核苷酸單鏈片段(尤其待合成基因在100個核苷酸以上時),每個片段長度控制在40~60個堿基,并使每對相鄰互補的片段之間有大于6bp交叉重疊。在體外將所有對應的片段混合經PCR反應即可拼接得到較長的基因片段。采用分步連接、亞克隆的方法時,最后將亞克隆的較大片段重組為完整的基因。為便于亞克隆中回收基因片段,應在片段兩側設計合適的酶切位點;由于每個亞克隆可以分別鑒定,從而可減少順序錯誤的可能性。

(2)酶促合成:此法又稱基因的半合成法。全基因合成,特別是較大的基因的全部化學合成成本昂貴,使用半合成的方法可以降低成本,從而利于普及使用。首先合成末端之間有10~14個互補堿基的寡核苷酸片段,退火后以重疊區作為引物,在4種dNTP存在的條件下,通過DNA聚合酶或反轉錄酶的作用,獲得兩條完整的互補雙鏈。合成基因的結構應包括有克隆和表達所需要的全部信號及DNA順序,基因密碼子的閱讀框架也應該同表達體系相適應。此外,由于不同物種的密碼子使用偏好性,在基因合成和克隆時必須考慮這個問題。可通過密碼子優化獲得高效表達。

最常見的獲得目的基因的方法是PCR擴增釣取基因。但很多的時候,擴增只會得到痕量或根本就得不到目的基因。如果用這種方法,首先,必須準備某一特定組織的cDNA文庫,就必須花時間去準備或訂購。其次,目的基因在文庫中的含量必須充足,否則就可能會找不到合適的方法釣取或克隆得到。第三,PCR擴增得到的目的基因可能會含有許多點突變或單核苷酸多態性,這會給您后期的實驗應用帶來極大麻煩。

(4)本公司收到預付款后立即安排生產,進行引物合成、DNA片段拼接等工作,將全長基因克隆于載體中,通過DNA測序確認合成基因的正確性;對錯誤位點用定點突變方法進行修復,最后得到與客戶提供序列完全一致的基因;

有必要。不同來源的種屬密碼子的偏好性不同。比如,在人體內受偏愛的密碼子對于E.coli來說可能是稀有的。百力格公司已經為國內外客戶優化了大量的基因,有自主研發的專業軟件。可免費為客戶提供密碼子優化服務。

(2)pTG19-T載體:適用于T/A克隆;另外,本公司還有近300種商業表達載體(如pET系列,pPIC系列)可供基因合成后克隆選擇;若有特殊要求,需換到一些特殊載體或改造過的載體,為方便后續實驗的及時進行,請提供載體及相關的載體信息。

基因合成包括一個完整的流程:序列分析、優化、引物設計與合成、引物拼接與PCR擴增,PCR產物的T/A克隆,測序篩選,點突變修復、發貨準備等一整套服務,而引物合成只是基因合成工作中的一小部分。如同買一輛汽車與買一堆鐵塊和橡膠是一個道理。

所有在百力格合成的基因,都經過100%測序驗證。百力格公司基因部擁有獨立的分子生物學實驗平臺;本公司引物合成部、測序部,分子生物學試劑盒部,是基因合成部的根本保障。基因部主管擁有十年以上專業合成基因的工作經驗,基因合成的工作團隊均經過專業、嚴格的培訓,能保證所承接項目順利進行。

低GC含量序列:低GC含量的基因序列一般是指全長GC含量低于20%的基因,或100bp以內GC含量少于10%的序列;對于低GC片段,不包含發卡結構、反義互補、重復等其它復雜結構,一般將其分割成200bp/段來合成,然后通過合適的內切限制酶酶切后連接(常用BsaI和BpiI,所以序列本身最好不含有這兩種酶切識別序列),這樣更易得到正確的克隆,但是發貨期將比正常序列更長一些,而且價格也比常規基因稍貴。一般低GC序列都可以合成并可通過測序驗證。

高GC含量:高GC序列一般是指GC含量高于70%的序列或100bp以內GC含量高于80%的序列;與低GC序列不同,高GC序列難于測序,所以GC75%的序列合成業務,請特別詢價,對于此類序列也需要將其分割成300bp的片段來合成,需要合適的內切限制酶,如BsaI和BpiI。

(1)穿刺菌:請提供穿刺培養的單克隆菌落。穿刺培養的菌可以長時間保存而不會導致質粒的拷貝數明顯下降。樣品請在1.5ml或2ml的Eppendorf管中加入相應抗生素的固體LB培養基,然后將單菌落用牙簽穿刺于LB固體培養基中。