CUTampTag

浏览量: 55   / 时间:2019-12-15   /作者:线上体育平台

CUT&Tag(CleavageUnderTargetsandTagmentation,CUT&Tag)是一種研究蛋白質與DNA互作的新方法。該方法通過分子生物學手段將高活性的Tn5轉座酶與ProteinA融合,并裝載建庫接頭引物形成pA-Tn5轉座復合物。在抗體的引導下該pA-Tn5轉座復合物可靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。與傳統ChIP-Seq相比,該技術無需交聯與超聲打斷操作,規避了其所引起的抗原決定簇遮蓋和樣本損失問題,提高了信噪比,并使所需細胞量減少(可低至60個)。與CUT&Run相比,該技術在pA-Tn5轉座復合物進行切割時在切割片段的兩端加上接頭序列,可直接PCR建庫,無需末端抹平和接頭連接的操作,省時高效。

CUT&Tag技術可從基因組范圍內檢測組蛋白、RNApolymeraseII和轉錄因子等蛋白質結合的DNA區端,應用于臨床和科研的表觀遺傳學研究。或是結合生物信息學分析,找到轉錄因子下游調控的靶基因,為進一步闡明生物學機制提供依據。

細胞先與包被刀豆蛋白A的磁珠(ConcanavalinA-coatedmagneticbeads,ConAbeads)吸附結合,方便后續操作。用非離子去污劑洋地黃皂苷(Digitonin)進行細胞穿孔后,依次孵育針對靶蛋白的一抗、相應的二抗、pA-Tn5融合蛋白。其中pA-Tn5中的pA可以識別二抗的Fc區域,Tn5酶在加入Mg2+后定向切割靶蛋白附近的DNA序列。且Tn5酶進行切割時會在切割片段的兩端加上接頭序列,因此切割產物可以直接PCR擴增建庫,經純化后用于高通量測序。