【回顧】一代二代三代測序技術

浏览量: 51   / 时间:2019-12-15   /作者:线上体育平台

第一代測序技術-Sanger鏈終止法一代測序技術是20世紀70年代中期由FredSanger及其同事首先發明。其基本原理是,聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核苷酸的單鏈DNA分子區分開來。一代測序實驗的起始材料是均一的單鏈DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每個分子的相同位置上退火,然后該寡聚核苷酸就充當引物來合成與模板互補的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑(雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH基團,所以可被用作鏈終止試劑)通過聚合酶的引物延伸產生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法。測序引物與單鏈DNA模板分子結合后,DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應分四組進行,每一組分別用四種ddNTP(雙脫氧核苷酸)中的一種來進行終止,再用PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。

大規模平行測序平臺(massivelyparallelDNAsequencingplatform)的出現不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一,還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的特權能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測序技術有助于人們以更低廉的價格,更全面、更深入地分析基因組、轉錄組及蛋白質之間交互作用組的各項數據。市面上出現了很多新一代測序儀產品,例如美國RocheAppliedScience公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexatechnology公司合作開發的Illumina測序儀、美國AppliedBiosystems公司的SOLiD測序儀。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上,通過技術創新,用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP,當DNA聚合酶合成互補鏈時,每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光,根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理,從而獲得待測DNA的序列信息。

OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子測序技術正向著高通量低成本長讀取長度的方向發展。不同于第二代測序依賴于DNA模板與固體表面相結合然后邊合成邊測序,第三代分子測序,不需要進行PCR擴增。(1)HelicoBioScience單分子測序技術

該測序是基于邊合成邊測序的思想,將待測序列隨機打斷成小分子片段并用末端轉移酶在3'末端加上poly(A),以及在poly(A)的末端進行熒光標記和阻斷,把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來獲得已經雜交模板所處的位置,建立邊合成邊測序的位點加入聚合酶和被Cy3熒光標記脫氧核苷酸進行DNA合成,每次只加入一種脫氧核苷酸,然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫,直接對Cy3成像,觀測模板位點上是否有熒光信號,然后化學裂解核苷酸上的燃料并釋放加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物,進行下一輪反應。(2)PacificBioscienceSMRTT技術

該測序也是基于邊合成邊測序的原理,這項技于使用了Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零級波導)。測序的過程:被熒光標記磷酸集團的核苷酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結合(每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標記),被激發出熒光,在熒光脈沖結束后,被標記的磷酸集團被切割并釋放,聚合酶轉移到下一個位置,下一個脫氧核苷酸連接到位點上開始釋放熒光脈沖,進行下一個循環。(3)OxfordNanoporeTechnologies的納米孔單分子測序技術

大多數納米孔測序技術的基本原理是當DNA分子或者它的組成堿基從一個孔洞經過時而檢測到被影響的電流或光信號。OxfordNanopore測序技術是以α-溶血素來構建生物納米孔,核酸外切酶依附在孔一側的外表面,一種合成的環糊精做為傳感器共價結合到納米孔的內表面。這個系統被鑲嵌在一個脂雙分子層內,為了提供既符合堿基區分檢測又滿足外切酶活性的物理條件,脂雙分子層兩側為不同的鹽濃度在適合的電壓下,核酸外切酶消化單鏈DNA,單個堿基落入孔中,并與孔內的環糊精短暫的相互作用,影響了流過納米孔原本的電流,腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號大小很相近,但胸腺嘧啶在環糊精停留是時間是其他核苷酸的2-3倍,所以每個堿基都因其產生電流干擾振幅是特有的而被區分開來。